Все чаще в современной медицине можно услышать о ПЦР-диагностике, или полимеразной цепной реакции. Эта услуга может показаться сложной и непонятной для большинства пациентов, но на самом деле это современный метод постановки диагнозов, связанных с инфекционными и вирусными заболеваниями. В этой статье мы расскажем, как работает ПЦР-метод, какие преимущества он имеет и какие этапы включаются в процесс его проведения.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это сложный биохимический процесс, который позволяет умножать исходный ДНК-образец множество раз. Этот метод основывается на использовании фермента, который осуществляет копирование ДНК-цепей. Копирование проходит в специальных пробирках, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, которую можно наблюдать в виде ее усиления.

Одно из преимуществ ПЦР-метода заключается в том, что он может обнаруживать вирусы и бактерии, которые не видны при обычном исследовании. Этот метод также позволяет определить наличие этих инфекций в тканях и жидкостях пациента.

Чтобы провести ПЦР-диагностику, необходимо взять материал для исследования — кровь, мочу, слюну или другие биологические жидкости. Затем проводится этап подготовки образца для реакции, после чего он помещается в аппарат для дальнейшей обработки.

Итак, ПЦР-метод является современной и перспективной технологией в диагностике инфекционных и вирусных заболеваний, которая использует определенные этапы и подходы для максимального качества анализа. Если вам требуется постановка диагноза в таком случае, не стесняйтесь обратиться к данному методу.

Существует целый ряд методов диагностики различных заболеваний, однако диагностика методом ПЦР зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. Методом ПЦР занимаются уже более 30 лет, и за это время он значительно эволюционировал.

Основой метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. Этому способствуют ферменты и изменения температуры (от 50 до 95°С). В результате процесса, называемого амплификацией, из одной молекулы ДНК возбудителя в биологической пробе пациента образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Процесс образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и после тридцати-сорока циклов новых молекул становится достаточно для проведения подробного анализа методом электрофореза.

В дополнение к простой амплификации фрагментов ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Из-за этих возможностей ПЦР может использоваться не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

Процедура ПЦР-диагностики проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. Сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов РНК. В некоторых модификациях можно использовать режим амплификации при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Этот метод не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет использовать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше повышает точность использования ПЦР-диагностики.

ПЦР-диагностика - метод анализа, широко используемый в клинической медицине для выявления различных заболеваний. Данный метод имеет множество сфер применения, среди которых можно выделить следующие:

В урогинекологии

Метод помогает выявлять инфекционные заболевания, слабо проявляющие свои симптомы и имеющие хронический характер. ПЦР-диагностика позволяет определять наличие половых инфекций, таких как хламидиоз, микоплазма, уреаплазма, трихомониаз, гарднерелла, кандида, гонококк и трепонема. Кроме того, данный метод позволяет детектировать группу вирусов, поражающих урогенитальный тракт обоих полов, включая вирус герпеса и вирус папилломы человека. Своевременное выявление и лечение данных инфекций способствует избежанию риска развития злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.

В неонатологии

ПЦР-диагностика используется для выявления наличия неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. Данный метод является эффективным при выявлении опасных инфекций, таких как цитомегаловирус, токсоплазмоз, вирусы краснухи и герпеса, хламидии и микоплазмы.

В службе крови

Метод применяется для избежания риска переливания крови или плазмы, инфицированной опасными заболеваниями (ВИЧ, сифилис, гепатиты). ПЦР-диагностика значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку метод способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.

В клинике инфекционных заболеваний

Метод помогает выявлять заболевания, такие как гепатит, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.

В фтизиатрии и пульмонологии

ПЦР-диагностика позволяет выявлять возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, данный метод позволяет не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, выявить конкретный штамм. Также метод ПЦР используется для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Другие сферы применения

Следует отметить, что ПЦР-диагностика имеет множество других сфер применения, таких как криминалистика, экспериментальная медицина, создание генетических паспортов, мониторинг состояния окружающей среды, анализ продуктов питания, фармакология и ветеринария.

Оценить наличие возбудителя инфекции в организме иногда не так просто. Именно поэтому ПЦР-диагностика получила такое широкое распространение в медицинской практике. Она является более точным и надежным методом, чем многие другие аналитические способы, и имеет ряд явных преимуществ:

С помощью ПЦР-метода можно непосредственно определить наличие возбудителя инфекции. К примеру, иммуноферментный анализ (ИФА) выделяет только белки-маркеры, которые являются побочным продуктом жизнедеятельности микроорганизмов, и поэтому указывает на наличие инфекции косвенно. С другой стороны, ПЦР-анализ выявляет специфические участки в ДНК и с большой точностью указывает на присутствие конкретной инфекции.

Высокая специфичность ПЦР-диагностики обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляются лишь фрагменты ДНК, которые характерны только для определенных возбудителей инфекции. Это исключает вероятность ложных результатов анализа, чего неизбежно можно заблюдать в иммунологических методах, где ошибки возникают из-за перекрестной реакции антигенов.

ПЦР-диагностика также отличается от многих других методов высокой чувствительностью. Она позволяет выявить наличие даже единичных клеток вирусов или бактерий в таких случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. Например, ПЦР позволяет выявлять всего 10-100 клеток в пробе, в то время как при использовании иммунологических и микроскопических тестов для определения инфекции необходимо иметь не менее 103-105 клеток.

Применение универсальных методов лабораторных исследований, которые диагностируют сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы, является еще одним плюсом ПЦР-диагностики. Этот метод может применяться для выявления возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания и других материалах.

Скорость получения результатов является еще одним преимуществом ПЦР-диагностики. Поскольку для проведения анализа не нужно производить посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени не требуется. Весь цикл от забора биоматериала до получения результатов занимает всего 4-5 часов.

В заключение, метод ПЦР-диагностики известен своей способностью диагностировать трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, которые могут вызывать скрытые инфекции.

Ограничения ПЦР-диагностики

Несмотря на то, что метод ПЦР-диагностики считается весьма эффективным, у него все же имеются ограничения. Однако их количество настолько мало, что это не может негативно сказаться на популярности и результативности данного метода.

Вероятность амплификации ДНК возбудителя может сохраняться даже после его гибели. При проведении теста для контроля эффективности лечения, необходимо учитывать определенные требования, в частности, проводить его через некоторое время после полного исчезновения возбудителя инфекции в организме – обычно это занимает от 1 до 2 месяцев.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Праймеры – это фрагменты ДНК, подбираемые на основе знаний о генетической структуре конкретного возбудителя. Теоретически, такой же фрагмент может находиться в геноме других микроорганизмов, генетический код которых еще не расшифрован. Их наличие в тест-пробе может привести к неверному результату анализа.

Микроорганизмы могут изменяться, что может усложнить анализ при помощи ПЦР-диагностики. Иногда возникновение некоторых штаммов возбудителей может не выявляться в результате таких анализов.

В целях снижения рисков возникновения ошибочных результатов разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР имеет несколько этапов, которые проводятся в специальной лаборатории.

Первым этапом является забор биоматериала. Эта процедура проводится с помощью стерильного оборудования и только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть различные эпителиальные соскобы, моча, мокрота, кровь, сыворотка, плазма, биологические жидкости, а также биоптаты. Запрещено попадание следов крови в материал.

Следующий этап - хранение и транспортировка биоматериала. Образцы можно хранить на комнатной температуре в течение не более 2 часов или в холодильнике на температуре 2-8°С не более 1 суток. Некоторые биоматериалы допускают замораживание на срок до 2 недель, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Если требуется транспортировка, то пробы следует помещать в специальные термоконтейнеры или термосы.

Далее производится выделение ДНК из образца методом твердофазной сорбции. Затем в микроцентрифугу добавляется амплификационная смесь, после чего пробы устанавливаются в программируемый термостат и проводится амплификация. Время проведения зависит от заданной программы и составляет 2-3 часа.

После амплификации проводится регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяется методом электрофореза и образуется светящаяся полоса при облучении ультрафиолетовым излучением. Наличие светящейся полосы в ультрафиолетовом свете свидетельствует о положительном результате.

Интерпретация результатов исследования позволяет сделать выводы о наличии или отсутствии инфекции в организме человека. Количественный результат ПЦР-анализа может помочь врачу определить степень активности заболевания и выбрать соответствующее лечение.

Стоимость ПЦР-диагностики: Что влияет на цену?

Цена на ПЦР-диагностику может очень сильно варьироваться и зависит от нескольких факторов. Как отмечается в статье, стоимость анализа зависит от конкретной инфекции, на которую пациент планирует проверяться, а также от вида анализируемого материала и методики тестирования - качественной или количественной. В разных медицинских клиниках цена за определение одной инфекции может варьироваться от 200 до 800 рублей.

Но это не все затраты, связанные с проведением ПЦР-диагностики. К стоимости анализа добавится оплата за забор биоматериала, которая составляет около 400 рублей. Примерные цены на анализы ПЦР в Москве приведены в таблице 1, где указаны цены на определение ДНК и РНК различных инфекций и вирусов.

Кроме того, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно, включая несколько анализов в одном пакете услуг. Например, «ПЦР-8», который включает в себя восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций, обойдется в 1400 рублей, а «ПЦР-12», включающий 12 половых инфекций, - в 3500 рублей. Комплексное проведение анализов позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку отдельное прохождение ПЦР-диагностики для каждой инфекции будет гораздо дороже.

Фото: freepik.com